Grenzverdünnungsklonen

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    • Grenzverdünnungsklonen

      Hallo miteinander (diesmal vorallem die Biologen und Biochemiker 8) )

      Nachdem ich am Mikromanipulator gescheitert bin, möchte ich mich mal im Grenzverdünnungsklonen versuchen (Danke Lars für die Erklärung!), um aus einer Mischkultur zwei Reinkulturen zu erhalten, und bin mir nicht sicher ob ich alles richtig durchdacht und berechnet habe:

      Mit Neubauer improved Zählkammer (Danke Beni!) inkl. Deckglas (Danke Mäge!) habe ich 5 Gruppenquadrate der unverdünnten Mischkultur ausgezählt. Ergebnis: 247 Zellen A, 133 Zellen B. Das bedeutet 12,35 Mio Zellen A und 6,65 Mio Zellen B pro ml. Soweit richtig?

      Nun möchte ich eine Verdünnung dieser Kultur, sodass in jedem dritten Tropfen eine Zelle A ist. Das würde bedeuten in jedem sechsten Tropfen ist eine Zelle B. Von dieser Verdünnung will ich dann jeweils einen Tropfen in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte geben, und diese mit Nährlösung auffüllen, um daraus reine Kulturen zu bekommen.

      Zwischenfrage: aus 96 Tropfen, wie viele Reinkulturen aus Zellen B sollte es theoretisch geben?

      Und weiter: etwa 21 Tropfen ergeben einen ml, statistisch jeder dritte Tropfen soll eine Zelle A enthalten -> 7 Zellen pro ml. Ergibt eine Verdünnung von knapp 2 Millionen. 2 Tropfen Mischkultur (100 ul) in 1 dl verdünnt = 1:1000. Davon 2 Tropfen in 2 dl verdünnt = 1:2'000'000. Richtig?

      Eines der 5 Gruppenquadrate:

      Zählkammer.jpg

      Wenn mir jemand sagen könnte ob ich auf dem richtigen Weg bin wäre ich froh!

      Gruss Christian
      Mitglied VMN und SDAT
    • hoi christian,

      ja du bist da sehr gut dran, der name habe ich anderst gelernt und ich sage dem feinselektionierung über mehrere wieder angesetzt kulturen. darum währe der orbitalschüttler das beste für uns christian.
      auf dem bild seh ich tetraselmis und oculata. die stäbchenform kannst du selektioniernen wie ich dirs gezeigt habe. sonst nimm mein pipettenautomat mit beim nächsten besuch.

      uh christian,geil wen ich höre 12millionen pro ml dan ist ja unser phyto ja schön dicht.hihi. danke für die info. normal wird so von 6millionen erzählt in den produkten. (tote zellen).
      Gruss Fischerjoe
      Mitglied im VMN

      Ein paar Aquarien von 5ml bis 280 Liter. (I) Phyto und Zooplankton Kulturen.
      Neid muss man sich erarbeiten,den kriegt man nicht umsonst. Man gönnt sich ja sonst nichts !

      Dieser Beitrag wurde bereits 1 mal editiert, zuletzt von Fischerjoe ()

    • hallo thomas,

      ja ich will dich nicht stressen, bin einfach immer dran und bleib am ball. ich will da technisch weiter kommen ohne budge leider und bin ja mit euch auf sehr gutem wege.

      @christian, habe die selektion in dein mini schüttler getan und gefilmmt. super sache bis auf die turenzahl, leider wurden die zellen flockig und haben sich verklebt heute mittag. kontrolle wie immer bei mir.
      aber super zum zuschauen. war wie hypnotiesiert gestern. oder lags am bier.hihi :rolleyes:

      Bauherr Christian mini Orbitalschüttler
      Gruss Fischerjoe
      Mitglied im VMN

      Ein paar Aquarien von 5ml bis 280 Liter. (I) Phyto und Zooplankton Kulturen.
      Neid muss man sich erarbeiten,den kriegt man nicht umsonst. Man gönnt sich ja sonst nichts !

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    • Hallo Christian

      du musst die äussersten 4 Quatrate auszählen (Die ohne die feinen linien!) diese Zahl/4*10'000 = anz. zellen/ml

      du kannst die zellen vorher verdünnen, dann musst du einfach noch den verdünnungsfaktor mitberechnen! d.H bei einer 1:1 verdünnung *2 bei 1:2 *3 etc...

      Gruss Beni

      PS: falls du wirklich eine 1 zell kultur starten willst, würde ich dir eine 96er platte empfeheln und ganz wichtig, jedes einzelne well im mikroskop anschauen, denn slbst bei einer 96er platte wirst du ma 10 einzel kulturen finden!!!



      gruss Beni
    • hoi beni,

      das hab ich selber jetzt gemacht mit einem alte zählregal fürs micro. ja dan bin immernoch überzeugt mit 9 millionen zellen. habs aufgerechnet und frohes schmeicheln hersch.
      ja dan bin ich als unerfahrenen ja der top kultivierer. schön so sachen zu hören.
      ich habe pro zelle im messer 132 zellen gesehn uhh viel, schön das ich kein idiot bin. habs ja bei euch gelernt,
      unser llyod hat mich so weit gebracht das ich jetzt plöffen darf.
      keiner hat im verkauf die anzahl wie wirs sie haben. danke für den ruhm.
      Gruss Fischerjoe
      Mitglied im VMN

      Ein paar Aquarien von 5ml bis 280 Liter. (I) Phyto und Zooplankton Kulturen.
      Neid muss man sich erarbeiten,den kriegt man nicht umsonst. Man gönnt sich ja sonst nichts !
    • bei der rohdomonas habe ich pro tropfen über 1079 zellen gezählt, ja geil sowas.pro ecke, es wird sicher das 5-9 fache sein.
      Gruss Fischerjoe
      Mitglied im VMN

      Ein paar Aquarien von 5ml bis 280 Liter. (I) Phyto und Zooplankton Kulturen.
      Neid muss man sich erarbeiten,den kriegt man nicht umsonst. Man gönnt sich ja sonst nichts !
    • Hoi Beni

      OK danke für den Hinweis! Ich dachte ich halte mich eher an die Thombozyten als an die Leukozytenzählung , da sie von der Grösse her besser zu 2-3 um passen. Dann muss ich verdünnen, damit ich nicht 1000 Zellen zählen muss. Ob ich ein grosses Quadrat im Okular ganz sehen kann muss ich auch ausprobieren. Ist aber eine Riesenfläche... Und ob ich ein Well unter den Mikroskop scharf kriege?
      Was für einen Boden würdest du mir empfehlen? C? U?

      Gruss Christian
      Mitglied VMN und SDAT
    • Hallo Christian
      Ich mache immer die Leukocyten zählung, meine zellen sind aber min 15mu gross...
      natürlich geht die ander methode auch, da kenn ich mich aber nicht aus...
      dein plann mit nicht adehrenten zellen ist etwas aufwendig! in deinem fall würde ich V Boden nehmen, in der hoffnung die zelle setzt sich in der mitte! bei C und U kannst du lange suchen! hast du Platten?


      Es wird auf jeden fall ziemlich kompliziert wirklich einzelne zellen zu isolieren....

      Gruss Beni
    • Hoi Beni

      Platten habe ich noch keine, ich habe nach dem Boden gefragt um mir dann die richtigen von irgendwoher zu besorgen 8)

      Muss ich die Zellen denn finden auf der Platte? kann ich nicht Verdünnen, beschicken, auf den Schüttler legen und warten bis sich in einzelnen Wells neue Kulturen bilden?

      Ich will die Kügelchen. Vom Dichtegradientenzentrifugieren kann ich im Heimlabor ja warten, bis sich die Mischkultur etwas setzt, von verschiedenen Höhen Proben nehmen und schauen ob die Kügelchen oder die Stäbchen schneller sinken.

      Gruss Christian
      Mitglied VMN und SDAT
    • Hallo Christian

      Wenn du wirklic h single zell kulturen willst, musst du die zelle finden.
      wenn dein Ziel reinkulturen sind, dann reicht deine methode (Dann solltest du aber den titel ändern, denn in dem fall ist es kein Grenzverdünnungsklonen mehr, denn da gest du von 1ner zelle aus!)

      gruss Beni

      PS: boden spielt keine rolle!

      gruss Beni

      Dieser Beitrag wurde bereits 1 mal editiert, zuletzt von L_beni ()

    • Hoi Christian

      Wies halt so läuft, kommt immer wieder mal was dazwischen.. Aber letzte Woche ist ein Orbitalschüttler, der tagelang durchlaufen kann, fertig geworden, und somit kann dann auch bei diesem Projekt weitergehen.
      Einlesen kannst du dich, indem du nach einschlägigen Stichworten suchst, wie immer bringen englische Suchen mehr Treffer.
      Für Zooplankton suchst du dir ein Weibchen mit Eisack aus einer Kultur und setzt es als neue Kultur an - die Geschwister bilden eine neue Population.

      Gruss Christian
      Mitglied VMN und SDAT